imToken钱包app安卓|wb封闭时间过长会怎么样

作者: imToken钱包app安卓
2024-03-09 21:52:48

WB的无敌战神之路——封闭 - 知乎

WB的无敌战神之路——封闭 - 知乎切换模式写文章登录/注册WB的无敌战神之路——封闭PTMBio景杰生物WB做得好，导师捡到宝。对于刚入实验室的热血青铜宝宝，WB可谓处处都是轰炸区，一个不小心，分分钟落地成盒。为了帮助大家快速get变强秘籍，提升吃鸡率，我们在此重磅推出《WB实验全攻略》系列文章，助力各位早日成为实验室MVP，进阶WB无敌战神。在上一期的分享中，我们介绍了如何湿转 (WB的无敌战神之路——转膜)，今天将接着介绍封闭，我们开始吧～封闭的目的：蛋白通过非共价作用力吸附于膜表面，但是膜上很多位置并未吸附蛋白，封闭液中的蛋白成分可以与膜表面的空白位置结合，从而避免一抗的非特异性结合，产生非特异条带或者背景杂乱。01|封闭液的选择正确的封闭液可以促使抗原抗体更好的结合。对于封闭液的选择，可以通过抗体说明书确定有无特殊的封闭方法，也可根据实验结果进行相应调整。小编在这里给大家总结了常见的封闭液以及它们的优缺点。Ⅰ 脱脂奶粉脱脂奶粉成分复杂，含有多种蛋白，封闭全面。大部分情况下，脱脂奶粉是首选的封闭液 (浓度2.5-5% w/v)，经济实惠，可以达到较好的封闭效果。但因含少量残留的生物素和碱性磷酸酶 (AP)，它不适用于生物素标记和AP标记的抗体系统。脱脂牛奶也不适用于磷酸化蛋白的检测分析，因为奶粉中含有的酪蛋白是一种磷酸化蛋白，会导致抗体的非特异性结合，使条带背景变脏。Ⅱ 牛血清白蛋白 (BSA)脱脂奶粉不能用于磷酸化蛋白的封闭，分析磷酸化蛋白理论上要用BSA (浓度2-5 % w/v)。WB结果显示，相较于脱脂奶粉，BSA更适用于磷酸化蛋白的检测。遥想当年，我还不知道磷酸化蛋白封闭需要用BSA，一个磷酸化蛋白我整整跑了一个月，总是背景高，血的教训哪！虽然BSA成分单一，但普通级别的BSA可能含有IgG或其他血清蛋白，这些蛋白会与哺乳动物抗体 (如抗牛、山羊、绵羊、马等二抗) 产生交叉反应，增加非特异性背景信号，因此建议使用不含IgG的BSA产品。相对于脱脂奶粉，BSA不含生物素，对于生物素标记的抗体系统而言，可能BSA是最好的选择。Ⅲ 血清血清如胎牛血清FBS含有大量的蛋白质，可以用于封闭。但与BSA一样，它含有免疫球蛋白和血清蛋白，这些蛋白会和哺乳动物抗体产生交叉反应，增加非特异性背景信号。而且血清价格更加昂贵，需要的浓度更高 (5-10 % w/v),因此在WB实验中血清一般用的较少，它更多地应用于免疫组化和免疫荧光实验中样本的封闭。Ⅳ 明胶明胶是胶原蛋白的产物，从冷水鱼皮肤中提取出来的明胶即使在低温情况下也不会凝固，通常使用浓度为0.1-5 % (w/v)。与BSA和血清不同，它不含任何血清蛋白，因此不会和哺乳动物抗体产生交叉反应，这大大降低了非特异性背景信号。但鱼胶含有内源生物素，因此不适用于生物素标记的抗体系统。Ⅴ 混合封闭液有研究表明[1]，混合型液封闭效果 (脱脂奶粉+BSA+FBS+明胶) “秒杀”前四种封闭液。如图1所示，不难看出，混合型封闭液的封闭效果最好，信号最强 (该实验使用的是HRP标记的抗体系统)。图1 不同的封闭液对高分子量蛋白CFTR表达的影响/Nitrocellulose：NC膜；FBS：胎牛血清；Gelatin：明胶；Blotto：脱脂奶粉；Mixture：混合液Ⅵ 酪蛋白相对于AP标记二抗，HRP标记二抗灵敏度更高，酶促反应更快。绝大多数实验室用的都是HRP标记二抗。如果有实验室用的是AP标记二抗，小编建议用1 % w/v的酪蛋白进行封闭。酪蛋白在中性和碱性条件下带有负电，会与带正点的膜相互作用，可以用于AP标记的抗体检测系统，缺点是溶解性相对较差~02|封闭的流程01、转膜结束前30 min，以TBST为缓冲体系 (配方见文末) 配置封闭液，并利用涡旋仪、摇床等仪器使封闭液充分溶解并混匀；02、转膜结束后，在抗体孵育盒中加入适量封闭液，并用镊子夹住条带，将其完全浸泡在封闭液中，置于摇床上室温摇动孵育1-2 h，也可以4 ℃冰箱孵育过夜。03|问题解析WB的结果不理想有很多原因，下面我们就分析一下封闭可能会导致的问题吧～1. 条带上有黑色斑点奶粉未完全溶解。出现黑点最常见的原因是奶粉没有完全溶解，建议利用涡旋仪、摇床等仪器使奶粉充分溶解并混匀，或溶解后离心取上清液使用。图2 条带上有黑色斑点2. 条带背景高封闭时间过短。封闭的目的是使封闭液中的蛋白成分与膜表面的空白间隙结合，从而避免一抗的非特异性结合。封闭时间过短可能会导致一抗与空白间隙非特异性结合，背景变脏，可以增加封闭时间，或提高封闭液浓度。图3 条带背景高3. 条带信号弱过度封闭。条带信号弱，可以适当降低封闭液浓度，或者更换封闭液，封闭时间如果过长也可以考虑降低，但如果原本时间是1 h，不建议再缩短时间。但封闭过度很少见，条带信号弱可能要优先考虑其他条件，比如样品新鲜度、上样量、一抗二抗浓度等。图4 条带信号弱04|TBST配方发布于 2023-02-16 11:05・IP 属地浙江科学实验赞同 2814 条评论分享喜欢收藏申请

配图详解 12 个 WB 翻车原因 - 知乎

配图详解 12 个 WB 翻车原因 - 知乎切换模式写文章登录/注册配图详解 12 个 WB 翻车原因BOSTER经常做 western blot 的同学通常会有一种错觉这哪里是搞科研明明是搞「玄学」十个 WB 七个歪八个丑九个坏还有一个不出来要么条带失踪要么背景漆黑要么杂带丛生……有时就算凑齐天时地利人和也不一定能得到一组完美条带江湖传言：一个生物学博士，要跑满 1000 板胶才有可能毕业WB 实验本身就难还总是牵涉进「造假」「撤稿」「学术不端」等丑闻使得主流期刊对 WB 数据要求越来越高要求作者提供相关原始数据甚至要求提供未切割的 WB 全膜条带对于出道 29 年的大博士而言 WB 的「玄」之操作它早就积攒了一本厚厚的攻略【PS：由于排版字数限制，以下分享部分精华】收获这份攻略高灵敏度，高信噪比，更低背景……让你的条带显露真身跑胶是 WB 实验成败之母提高跑胶质量的 Tips蛋白分子量偏高或偏低可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说 100KD 的蛋白你用 12% 的胶跑，或者说 20KD 的蛋白你用 8% 的胶跑。蛋白质降解蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后出现一些其他带，最主要的特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。所有条带连成一片无间隔最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。溴酚蓝拖尾样品溶解不好或上样前未变性完全。纵向的纹理上样样品中存在不溶性颗粒。溴酚蓝很粗浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短或者配错。在分离胶中跑不动Tris-Cl pH 值不对，或者忘记加 SDS。BOSTER#1/无背景无条带http://www.boster.com.cn原因分析如果 marker 正常，其他位置没有条带，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。解决办法a. 目的蛋白完全无信号，但同时做的内参是正常的，那么大部分情况是一抗抗体失效或用错二抗。b. 目的蛋白和内参均无信号，则考虑是否发光液失效。如果膜上没有 marker 则为转膜失败。c. 如果中间出现了细微条带，可能是蛋白上样量太少，或一抗浓度过低。经验之谈上图展示一点信号都没有，大部分情况是因为抗体加错了。如果中间出现细微的条带，可能是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL 发光液失效。BOSTER#2/高背景http://www.boster.com.cn原因分析封闭不充分，一抗浓度过高，洗膜时间次数不够。解决办法降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。a.一抗/二抗浓度配比不合适：杂带多，大概率是抗体特异性不好，也有可能抗体浓度太高，可尝试降低一抗浓度进行实验。b.封闭液问题：配制封闭液所用的脱脂奶粉应选用无防腐剂实验专用脱脂奶粉。c.洗膜不充分：洗膜按规定来 5min*5 次或 10min*3 次。经验之谈高背景是 WB 实验中最常见的问题，目的条带单一清晰，但其他地方又弥漫性较均一的背景（比较连续的）。杂带多大概率是抗体特异性不好，也有可能抗体浓度太高，可尝试降低一抗浓度进行实验。BOSTER#3/非特异性条带http://www.boster.com.cn原因分析一抗非特异性与蛋白结合。解决办法更换一抗。经验之谈此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断哪一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然也有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。BOSTER#4/条带中出现边缘规则的白圈http://www.boster.com.cn原因分析a.电转中膜与胶之间存在气泡。b.可能是转膜过程烧膜了，特别是半干转操作不当导致烧膜。c.转膜时温度过高产生气泡。d.印迹膜活化不佳。解决办法a.注意排清气泡。b.优化实验条件或使用湿转法转膜。c.把整个转膜装置放于 -20 度冰箱中电转。d.确保印迹膜完全活化。经验之谈我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不宜太多或太少，建议高度与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住 NC 膜的两侧中间，使膜成 U 型，然后将 U 型底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用 U 型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下，最后盖上海绵。BOSTER#5/出现黑点和黑斑http://www.boster.com.cn原因分析a.一般出现这种情况可能是封闭液溶解不完全或封闭液存放时间太久（长菌）。b.膜上其他部位与一抗或二抗非特异性结合。解决办法a.过滤封闭液或选用其他类型封闭液。b.与其他品牌已验证过好用的抗体处理相同样本，作比较，看是否还有斑点。经验之谈牛奶溶解后，最好静止一下，然后轻轻吸取上层牛奶进行封闭，封闭结束后一定要洗 3 遍之后再加一抗。BOSTER#6/条带拖尾http://www.boster.com.cn原因分析一抗浓度太高和时间太长。解决办法根据情况调整一抗浓度，时间也可缩短。经验之谈这种情况一般出现在大分子量抗体实验中，是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减漏，建议 5min*5 次，不要担心洗这么多次把抗体和蛋白洗掉了，真正的抗原抗体相结合通过这种方式是洗不掉的。BOSTER#7/出现非均一性背景http://www.boster.com.cn原因分析膜可能在孵育或洗涤过程中干过。解决办法每一步的操作过程中，注意不要让膜干。经验之谈封闭时洗一抗洗二抗，以及发光时都应时刻注意切记蛋白面风干，一旦风干很可能会导致这个结果。BOSTER#8/某个条带变形http://www.boster.com.cn原因分析SDS-PAGE 胶中存在气泡或某不溶性颗粒。解决办法配胶过程中，要注意不要使用无杂质液体。经验之谈很多实验室中使用的不是最新设备，比如配胶用的海绵垫，如果用了很多年，会从下面往上面漏小气泡，当气泡足够小并且胶快凝固的时候，走到中间的小气泡就停留在胶内，并会影响到后面的跑胶。另外配胶用的水，SDS，Tris 缓冲液要注意不要有杂质。BOSTER#9/条带不均一http://www.boster.com.cn原因分析a.配置胶凝固不均一。b.转膜问题：转膜夹子不紧，转膜滤纸或海绵由于使用消耗，滤纸及海绵变薄，海绵弹性不足。c.一抗孵育问题：抗体孵育不充分或抗体稀释液放入过少。解决办法a.把胶配好，不合格的胶坚决不用。b.及时更换转膜滤纸和海绵。c.增大抗体稀释液用量、更换跷跷板类型的摇床将膜完全进入抗体稀释液中。经验之谈出现哑铃最大的可能是胶没有配好，胶凝固后不均一。如果你拔完梳子后出现上图中下面部分的情况，多半会出现哑铃状。另外还有一种可能是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉积在孔的中间，蛋白自然被推挤到两边。BOSTER#10/最边缘条带弯曲http://www.boster.com.cn原因分析电泳电流不均一，玻璃板右下侧有缺口。解决办法换用新的玻璃板，不使用两边的两孔。经验之谈一般我们使用的是 10 孔的胶，如果你上样刚好 10 个孔，那么最两头的两个孔肯定会歪曲。另外上样最好在胶的中间，这样电场均一。BOSTER#11/条带笑脸，marker正常http://www.boster.com.cn一般来说笑脸问题首先考虑电泳环节，多半是凝胶没凝固好。但上图 marker 却异常整齐，笑脸条带整齐地手拉手，这就不是凝胶问题导致的。原因分析a.loading buffer 失效，导致样品变性失败。b.上样量过大或样品杂质多。c.电压太高。解决办法a.更换 loading buffer。b.超滤样品或降低上样量。c.降低电压。经验之谈准备样本主要确认上样缓冲液是否为近期配置，并且要妥善保存，否则就会浪费珍贵的实验样本。一般电泳过程中恒压电泳，浓缩胶 80V，分离胶 120V，整个过程差不多需 2 个小时左右。BOSTER#12/曝光结果条带扭曲http://www.boster.com.cn原因分析转膜问题，对于分子量稍大的蛋白，转膜时间过长，转膜装置产热过多，无法维持转膜时的低温环境，造成条带扭曲。解决办法建议在条件允许的情况下直接在 4℃ 中进行转膜，将冰更换为冰水混合物，及时更换转膜液并将转膜液放入 4℃ 中提前预冷。经验之谈对于大分子量的抗体，跑胶前可以先把样本煮一下，然后稍微离心一下，同样也可以改善这种情况。发布于 2022-06-01 08:44犬科动物赞同 19914 条评论分享喜欢收藏申请

封闭问题可大可小，千万不能掉以轻心 - 知乎

封闭问题可大可小，千万不能掉以轻心 - 知乎切换模式写文章登录/注册封闭问题可大可小，千万不能掉以轻心南非姐姐Western Blot是检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化的首选方法，也是实验室常见的实验方法。完整的Western实验过程比较长，做一次Western也不容易。有结果当然是好的，没有结果也是常有的事，出现各种烦心结果也是时有发生。其中最常见的一种就数显色后背景高了。背景高，目的蛋白颜色对比不明显，要么看不清，图片展示不理想，更别说进行数据分析了。Western显色背景高的原因有很多：封闭的问题，洗脱问题，一抗二抗问题等。其中最显著的就是封闭问题。Western 实验中，PVDF膜在甲醇活化后是带电的，因而在转膜时将蛋白吸附。封闭的目的是就将PVDF膜上无蛋白的部分空隙填满，以免孵抗体的时候，一抗二抗与之结合，产生非特异条带或者是背景杂乱。封闭这一步还是比较关键的，封闭不好容易造成高背景。最常用的封闭也就是脱脂奶粉和BSA。封闭条件根据自己的实验选择，一般为5%脱脂奶粉或1～3%BAS室温封闭2-4h，但最好4度过夜。判断封闭条件，要考虑在此条件下是否能达到实验要求。从成本上来说，脱脂奶粉是首选，脱脂奶粉封闭的背景较低，又很经济，大部分实验都可以选用脱脂奶粉，但应该选用质量好的奶粉，但是选择的时候也不是随便那款奶粉都是适用来做实验的。一般进口奶粉会好点，主要是比较细腻，溶解起来方便点。一般来说脱脂奶粉对于多数抗体来说效果不错，但二抗与牛奶可能有交叉反应，因此洗涤很重要。另外BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。因为奶粉含有酪蛋白（一种磷蛋白），如果用奶粉，有可能出现背景深的现象。这就取决于抗体的质量了。还有也的看你是做什么体系的，如果是生物素和亲和素体系的，可能最好选用BSA了，因为奶粉中也含有生物素的，可能会干扰试验结果。另外选择BSA时，如果一抗来源的和封闭血清来源种属太接近，也会出现背景高的情况，这时就不能用BSA、种属太接近动物血清封闭。做磷酸化蛋白时，理论上来讲，最好用BSA可以降低背景，建议：先用脱脂奶粉，如果背景脏，就改为BSA。封闭液的浓度也可以提前优化，过低或过高都会造成不好的影响。过低封闭浓度势必造成本底过高，但过高又会使灵敏度降低，因此只要选择能够满足你试验要求的最低浓度就可以了。另外提醒，洗涤一定要彻底，很重要的。封闭是为了阻止PVDF膜与一抗的非特异性结合，避免杂带的出现或背景杂乱。在封闭过程中必然会损失血清蛋白，封闭液可以回收利用，-20度保存，但重复用多次后效果必然变差。封闭这一步还是比较关键的，封闭不好容易造成高背景，用量及封闭液体积在正常用量范围问题都不大，封闭的时间也可以适当延长。关于Western封闭今天就先说到这里，有任何疑问或问题可以随时交流，欢迎大家多多评论提意见～～～更多生物实验干货在英格恩生物技术博客查看！英格恩生物技术博客 - 生物实验干货分享发布于 2021-11-30 16:42生物实验分子生物学蛋白质赞同 94 条评论分享喜欢收藏申请

Western Blotting Immunodetection Techniques | Bio-Rad

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Introduction to Western Blotting

Western Blotting Immunodetection Techniques

Overview

Sample Prep

Electrophoresis

Transfer

Immunodetection

Image Acquisition

Image Analysis

Better Immunodetection

Information on antibodies, their selection, and use.

On This Page

Detection Overview

Blocking

Primary Antibodies

Secondary Antibodies

Detection Methods

Total Protein Detection

Tips & Protocols

Detection Overview

After transfer, proteins from the gel will be immobilized on the membrane. This section describes the process of specifically detecting your particular protein of interest in order to identify and quantify its presence and abundance in the sample. Western blot detection of proteins utilizes primary antibodies that are specific for the target protein which are then in turn recognized by secondary antibodies that are conjugated with enzymes or fluorescent molecules for detection. The correct selection and use of appropriate primary and secondary antibodies is crucial for maximizing signal while reducing background. The proper use of protein loading controls are also critical for signal normalization in quantitative western blotting. We discuss the most popular methods to detect total protein on the membrane for loading controls and their relative advantages and disadvantages.

The Immunodetection Workflow

Western Blotting Antibody Detection

After proteins are transferred from the gel to the membrane, antibodies specific to your protein of interest (primary antibodies) are incubated with the membrane to allow them to recognize their targets. A second incubation with conjugated antibodies specific to the primary antibodies (secondary antibodies) enables visualization by various methods.

Block unbound membrane sites

Membranes are incubated in a blocking agent that masks any sites on the membrane that would allow antibodies to bind non-specifically. Failure to do so raises background.

Incubate with primary antibody. Wash away excess.

Membranes are then incubated with primary antibodies that are specific to your protein of interest. These bind to their targets and any excess is washed away.

Incubate with secondary antibody. Wash away excess.

The membrane is then incubated with secondary antibodies that recognize the primary antibodies and are also conjugated to either an enzyme or a fluoroscent molecule. Any excess is washed away.

Develop signal

For secondary antibodies conjugated with an enzyme, the membrane is incubated with a chemical substrate that produces a signal that can then be detected. If the secondary is conjugated to a fluorescent label, the membrane can be directly imaged in an instrument capable of fluorescent imaging.

Blocking

Following transfer, unoccupied antibody binding sites on the membranes must be blocked to prevent nonspecific binding. Failure to completely block these sites can lead to high backgrounds that obscure the signal.

Various blocking reagents are available, and no single blocker will be optimal for all antibody/antigen combinations. The best blocker for each experiment will depend on the antibody and membrane type. Optimize the detection system for maximal signal with lowest background by testing several blocking agents. Modern formulations like Bio-Rad’s EveryBlot Blocking Buffer are universal, performing well across a wide range of targets, sample types, and detection methods.

Blocking duration also affects the signal and background levels. Blocking for 1 hour with constant agitation is a good starting point. Excessive blocking times may result in lower sensitivity as epitopes can be masked by the blocking agent and proteins washed off the membrane. In contrast, insufficient incubation times will increase nonspecific binding of the primary antibody. Advanced formulations like Bio-Rad’s EveryBlot Blocking Buffer can complete the blocking step in 5 minutes.

For detection of a phosphorylated form of a protein, blocking buffers should not contain phosphorylated proteins to avoid high background signal. Avoid use of nonfat dry milk and instead use BSA, casein, or advanced formulations that are compatible with phosphoprotein detection.

Quick Tips:

Optimizing the Blocking Step in Western Blotting

Watch the video to understand the experimental parameters and which type of blocking agent to use to ensure success of your western blot.

Agent

Pros

Cons

Non-fat milk (1–5%)

Inexpensive, widely available

Not ideal for phosphoproteins, biotin-avidin/streptavidin, or AP detection

Speckling if not completely solubilized

BSA (0.5–5%)

Recommended for phosphoprotein detection, AP/biotin-avidin detection

Not usable with antibodies created using BSA-coupled peptides, phosphotyrosine Ab

Casein (1–2%)

Balance of stringency & sensitivity

Ideal for most detection methods

Blocking may be insufficient for complex biological samples

Gelatin (1–5%)

Inexpensive, widely available

Fish gelatin does not cross-react with mammalian proteins

Porcine gelatin solidifies in cold blocking

Speckling if not completely solubilized

Cannot be used with avidin-biotin detection

Specialized

Advantage depends on product

Can be expensive

Primary Antibodies

An antibody is an immunoglobulin protein such as lgG that is generated in response to exposure to a foreign substance, or antigen. Antibodies have specific affinity for the antigens that elicited their synthesis.

Primary Antibodies

Primary antibodies are raised against a protein of interest and will selectively recognize and bind to target proteins that have been immobilized to a membrane. Antibodies can be designed to be specific for certain parts of a target protein, or they can be designed to be specific for only modified versions of the protein.

Primary Antibody Selection

Antibodies should be specific, selective, and give reproducible results. To ensure the specificity of the primary antibody, it is important to use positive and negative controls when running your blot. As a positive control, purified proteins or lysates overexpressing the target protein can be used. As a negative control, you can include secondary-antibody-only controls (omitting the primary antibody incubation step) and samples from a tissue or cell lysates known not to express the target protein such as cells engineered with a genetic knockout. Before performing the experiments review the literature in order to understand the expression profile of the protein

Selecting Primary Antibodies for Best Results in Western Blotting

Choosing a Primary Antibody for Multiplex Western Blotting

How to Select the Right Antibody

Bio-Rad has developed tips to consider when choosing your antibody.

See Antibody Tips

The wording good and bad antibody or the most specific antibody should be avoided, since a specific antibody in one sample context can give rise to high cross-reactivity in another sample context depending on the nature of the epitope(s) that it will recognize.

— Edfors et. al. 2018, Nature 9:4130

When selecting a phospho-specific antibody for your experiments, it is crucial to ensure that the antibody specifically detects the protein of interest only when it is phosphorylated at the indicated site. You might also want to consider treating cells with growth factors or chemical compounds that induce or inhibit expression of the target.

Monoclonal vs. Polyclonal Antibodies

The antibodies used to detect the target protein in a western blot will be either monoclonal or polyclonal. Polyclonal antibodies consist of a mixed pool of immunoglobulin molecules that bind to several different epitopes found on a single antigen. Polyclonals are usually produced in rabbits, donkeys, sheep, and goats, and are purified from serum.

In contrast, monoclonal antibodies bind to a single epitope within a target antigen. They are composed of homogeneous cloned immunoglobulin molecules, rather than the heterogeneous antibody mixture typical of polyclonals. Monoclonals are made by fusing antibody-producing cells from the spleen of the immunized animal (usually a rat or mouse) with an immortalized cell line to produce single specificity antibodies that can be purified from tissue culture supernatant.

Monoclonal

Polyclonal

Specificity

Specificity for a single epitope.

Varying specificities to multiple epitopes

Identification

Identifies whether a particular region of a protein is present

Identifies the entire target protein via binding at multiple sites. Since multiple epitopes are targeted, there is a higher likelihood of detection of the target

Cross-Reactivity

May cross-react with other proteins that share this epitope, such as isomers or common motifs

Higher background and cross-reactivity possible due to detection of multiple epitopes, any of which may be shared by related proteins

Sensitivity

Usually less sensitive since only a single antibody molecule binds to each target

More sensitive because signal is amplified through the binding of several antibodies per target

Cost

More expensive to produce initially, but available in an unlimited supply

Less expensive to produce initially, but supply is limited to immunized animal(s). Greater variability between preparations

Primary Antibody Incubation

After blocking, the membrane is incubated in a solution containing the primary antibody, usually diluted in blocking buffer. The time and temperature of incubation depends on the binding affinity of the antibody to the target protein and should be determined for each antibody individually. One hour at room temperature with gentle agitation is a good starting point. In order to reduce the background staining, the amount of Tween 20 used in the buffers is also important.

Antibody Concentration

The optimum antibody concentration is the dilution of antibody that still yields a strong positive signal without background or nonspecific reactions. Instructions for antibodies obtained from a manufacturer typically suggest a starting dilution range. For custom antibodies or for those where a dilution range is not suggested, good starting points are:

1:100–1:1,000 dilution when serum or tissue culture supernatants are the source of the primary antibody

1:500–1:10,000 dilution of chromatographically purified monospecific antibodies

1:1,000–1:100,000 dilution may be used when ascites fluid is the source of antibody

Quick Tips:

How to Optimize Primary Antibody Concentration and Incubation for Western Blots

Watch this video to explore considerations for optimizing incubation time and dilution of primary antibodies when performing a western blot.

See Our Western Blotting Primary Antibodies

Phospho-Specific Antibodies

Protein phosphorylation, the addition of a phosphate group to serine, threonine or tyrosine residues, is an important cellular process utilized to send cellular signals from the membrane to the nucleus. Protein phosphorylation may result in conformational changes that trigger the activation or inactivation of an enzyme.

Phospho-specific antibodies are primary antibodies that detect only the phosphorylated forms of proteins and recognize the phosphorylated serine, threonine, or tyrosine residues in the context of the rest of the protein. Using a combination of total protein detection (using primary antibodies that recognize both phosphorylated and non-phosphorylated forms of the protein) and phospho-specific antibodies, it is possible to assess the degree of phosphorylation for any given protein.

Prior to using phospho-specific antibodies, ensure that the antibodies have been validated for your experimental system. This can be accomplished by using positive and negative controls. For example, lysates from cells that are either untreated or have been treated to stimulate the pathway of interest can act as negative and positive controls. Likewise, absence of detection can act as a negative control on lysates that have been treated with lambda phosphatase to remove phosphate groups.

See Our Phospho-Specific Antibodies

Secondary Antibodies

Purification of Cross-Adsorbed Antibodies

A solution of secondary antibodies raised against mouse lgG is passed over a column containing immobilized serum proteins from potentially cross-reactive species such as rat or rabbit.

Only antibodies highly specific for mouse lgG will flow through the column, while antibodies cross-reacting to rat or rabbit will bind and remain in the column. The flow-through solution contains antibodies that specifically recognize mouse lgG.

Secondary antibodies are specific for the isotype and species of the primary antibody. For example, a goat anti-rabbit secondary is an antibody raised in goats against a primary antibody raised in rabbits.

Secondary antibodies bind to a number of different conserved regions on the primary antibody, and act to amplify the signal, increasing detection sensitivity. Secondary antibodies are labelled with either an enzyme for colorimetric or chemiluminescent detection or with a fluorescent dye for fluorescent detection of the protein of interest.

Cross-Adsorbed Antibodies

Secondary antibodies raised against primary antibodies of one species can recognize those from other species, especially if they are from closely related animals. For example, parts of the constant regions of mouse and rat antibodies are evolutionarily conserved, leading to conserved epitopes between both species. Since secondary antibodies are generally polyclonal, when generating secondaries against mouse, a subset of those secondaries will be specific for those conserved epitopes, being able to recognize them whether the epitope resides on a mouse or rat antibody. This cross-reactivity could lead to unexpected bands when multiplexing or cause high background.

To remove the undesired antibodies from a polyclonal pool, an affinity chromatography column is used to purify the secondary antibody preparation of offending cross-reactive species. Clonal antibodies that recognize the immobilized antigen(s) are removed. The unbound pool of antibodies is now cross-adsorbed against the immobilized antigen and should show no reactivity towards it.

The most common type of cross-adsorbed secondary antibody is species specific, which is most useful for multiplexing, although there are also instances when isotype-specific antibodies are required. For example, immunization with a purified IgG1 preparation might be expected to generate a serum with a specific reactivity towards IgG1 and no cross-reactivity with other antibody isotypes. However, due to the polyclonal nature of the serum combined with the conservation of some epitopes between classes and isotypes, a component of the polyclonal serum may react with an epitope on IgG1 that is also found on IgG2a, confounding the isotype specificity.

A solution of secondary antibodies raised against mouse IgG is passed over a column containing immobilized serum proteins from potentially cross-reactive species such as rat or rabbit.

Only antibodies highly specific for mouse IgG will flow through the column, while antibodies cross-reacting to rat or rabbit will bind and remain in the column. The flow-through solution contains antibodies that specifically recognize mouse IgG.

Secondary Antibody Concentration

Similar to primary antibodies, the optimum antibody concentration is the dilution of antibody that still yields a strong positive signal without background or nonspecific reactions. Fortunately, high-quality secondary antibodies are commonly available, and manufacturers typically suggest a starting dilution range.

See Our Western Blotting Secondary Antibodies

Quick Tips: How to Choose Secondary Antibodies for Multiplex Western Blotting

In this video, we discuss the best practices for selecting secondary antibodies that are compatible with your primary antibodies and your detection methods to produce high-quality, reproducible results.

Detection Methods

In the past, many different methods were used for western blot detection, but now the vast majority employ enzymatic chemiluminescence or fluorescent detection. Thus, most secondary antibodies are conjugated to an enzyme such as alkaline phosphatase (AP) or horseradish peroxidase (HRP) for use with a chemiluminescent substrate or labeled with a fluorescent compound for imaging.

Chemiluminescence Detection

Chemiluminescence is a chemical reaction in which the oxidation of a chemical substrate such as luminol is catalyzed by an enzyme, typically horseradish peroxidase (HRP), and the reaction produces light as a byproduct. The resulting light can be captured on film or by a digital imager.

Luminol emits light only weakly, so enhancers are added to the reaction to increase the signal. This enhancement of a luminol-based signal is commonly referred to as enhanced chemiluminescence (ECL). There are a number of different enhancers available, some of which can increase the signal by as much as a 1,000-fold, making ECL more sensitive than other common detection systems such as conversion of substrates to colored precipitates.

The light intensity will be roughly proportional to the quantity of your protein of interest, allowing semi-quantitation of relative protein abundance. Since this detection method relies on an enzyme-substrate interaction, the kinetics of the reaction plays a role in the linearity of the signal. Therefore, for more accurate quantitation, care must be taken to ensure that the sample load is within the linear range of the assay and the detection signal is not saturated.

Luminol oxidized by HRP in the presence of H2O2 leads to the formation of a 3-aminophthalate dianion and the release of light.

Quick Tips:

How to Image a Chemiluminescent Western Blot

Watch this video to see how to prepare a western blot membrane for chemiluminescent detection and ensure a strong chemifluorescent signal during image acquisition.

See Our Chemiluminescent Substrates »

Fluorescence Detection

In fluorescence detection, a primary or secondary antibody is labeled with a fluorescent molecule (a dye or fluorophore). A light source that produces photons within the fluorophore's excitation spectrum excites the fluorophore, and the fluorophore then emits photons with a longer wavelength. The difference in wavelength between excitation and emitted light is termed Stokes shift. This emitted light of longer wavelength can then be distinguished from the excitation light via appropriately designed optical filters and detected by a digital imager.

Fluorescence detection has a number of advantages over traditional chemiluminescent detection. As fluorescent detection does not rely on an enzyme-substrate reaction, the use of fluorophores can be more quantitative than chemiluminescent detection, is often faster, and reduces waste.

The greatest advantage of fluorescent western blotting detection over chemiluminescent detection is the ability to simultaneously detect a large number of proteins on one blot, using a process called multiplexing. This relies on choosing fluorophores that fluoresce at different wavelengths and can be distinguished by the digital imager.

Fluorophore Selection

When using fluorescence detection, consider the following optical characteristics of the fluorophores to optimize the signal:

Quantum yield — efficiency of photon emission after absorption of a photon. Processes that return the fluorophore to the ground state but do not result in the emission of a fluorescence photon lower the quantum yield. Fluorophores with higher quantum yields are generally brighter.

Extinction coefficient — measurement of how well a fluorophore absorbs light at a specific wavelength. Since absorbance depends on path length and concentration (Beer's Law), the extinction coefficient is usually expressed in cm -1 M-1. As with quantum yield, fluorophores with higher extinction coefficients are usually brighter.

Stokes shift — the difference in the maximum excitation and emission wavelengths of a fluorophore. Since some energy is dissipated while the fluorophore is in the excited state, emitted photons are of lower energy (longer wavelength) than the light used for excitation. Larger Stokes shifts minimize overlap between the excitation and emission wavelengths, increasing the detected signal.

Excitation and emission spectra — excitation spectra are plots of the fluorescence intensity of a fluorophore over the range of excitation wavelengths; emission spectra show the emission wavelengths of the fluorescing molecule. Choose fluorophores that can be excited by the light source in the imager and that have emission spectra that can be captured by the instrument. When performing multiplex western blots, choose fluorophores with widely separated emission spectra to enable good signal separation among the different color channels.

Fluorophore Stokes Shift

A high-energy photon excites a fluorophore, causing it to leave the ground state (S0) and enter a higher energy state (S11). Some of this energy dissipates, allowing the fluorophore to enter a relaxed excited state (S1). When the fluorophore returns to the ground state, a photon of light is emitted. Since some of the energy was dissipated, the emitted photon is of lower energy (longer wavelength).

The difference in wavelength between the exciting light and the emitted light is called the Stokes shift. Larger Stokes shifts minimize the overlap between the excitation and emission wavelengths, increasing the detection signal-to-noise ratio.

See Our Products for Fluorescent Western Blotting Detection »

Total Protein Detection

Total protein staining provides an image of the complete protein pattern on the blot. This information helps determine transfer efficiency and molecular weight of the transferred proteins. This information can also be used to determine relative quantity of sample that was loaded in each lane.

Several total protein stains are available and commonly used in western blotting. The table below provides an overview of total protein detection methods and applications.

Total Protein Detection Methods for Western Blotting

Detection Method

Sensitivity

Advantages

Disadvantages

Imaging

Anionic dyes (Ponceau S, Fast Green, Coomassie Brilliant Blue, Amido black)

100–1,000 ng

Inexpensive, rapid

Coomassie and Amido black are not compatible with downstream immunodetection

Epi illumination

Fluorescent stains (SYPRO Ruby and Deep Purple)

2–8 ng

Sensitive; most are compatible with immunodetection

Additional staining and destaining steps

Fluorescent capable digital imager with UV, visible light LED, or lasers

Stain-Free Imaging

2–28 ng

Rapid and convenient—ready in less than one minute, and no separate staining or destaining required. Sensitivity comparable to Coomassie

Requires use of Stain-Free Gels and compatible imager

Bio-Rad imagers

Stain-Free Imaging Technology

Bio-Rad's stain-free technology allows direct visualization, analysis, and documentation of protein samples in PAGE gels and on blots, without staining or destaining. Stain-free imaging provides equal or better sensitivity compared to Coomassie staining and eliminates organic waste disposal concerns.

Linear dynamic range provided by stain-free technology for total protein measurements. HeLa cell lysate dilutions from 80–2.5 µg total protein.

Learn More about Stain-Free Imaging Technology »

Total Protein Normalization

Bio-Rad’s stain-free technology can be used for total protein normalization of western blots. Total protein normalization uses the signal of all proteins in a sample to determine load. This approach is more robust against expression changes of any one protein to an experimental condition, which can occur when using a single “housekeeping” protein.

Learn More about Total Protein Normalization »

Immunodetection Tips and Protocols

Western Detection Tips

Use high-quality primary antibodies.

A good antibody is sensitive, meaning it can detect low amounts of your target, and is also specific, recognizing only the target, without giving spurious secondary bands. Antibody vendors are increasingly offering antibodies that have been certified for western blotting.

Use cross-adsorbed secondary antibodies.

Cross-adsorbed antibodies offer a lower chance of cross-reactivity and reduced background giving more reliable results. They are readily commercially available so they should be used whenever possible.

Optimize antibody concentration to maximize signal to background.

Sensitive detection of your target depends on high signal and low background. Reducing antibody concentration can reduce desired signal, but the greater reduction of background more than makes up for this.

For multiplex detection, first optimize antibodies to targets individually.

When detecting multiple targets simultaneously, carry out detection of each target individually first. This will simplify any needed troubleshooting.

Western Detection Protocols and Resources

Find the right products for you using the free Western Blot Selector Tool

Start Tool

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Start Tool

Western Blotting Protocol Library

Filter by your laboratory set-up and reagents to get a custom western blotting protocol that best fits your needs.

Stain-Free Western Blotting Guide

Find out how Stain-Free technology can revolutionize your western blotting.

Better Western Blotting Guide

Tips, Techniques, and Technologies from the Western Blotting Experts at Bio-Rad Laboratories.

Protein Blotting Guide

(PDF 7.2 MB)

Details on blotting technology, methods, products, tips, techniques, and troubleshooting guidelines.

Western Blot Doctor

Our self-help troubleshooting guide covers solutions to many common and not-so-common western blotting issues and helps your blots look their best.

Best Practice for Western Blot Detection of Phosphorylation Events

Ten tips to ensure robust data generation and cleaner blots.

Protocol: Detection of Phosphorylated Proteins by Western Blotting

This protocol describes how to detect phosphorylated proteins by western blotting using Phospho-Specific PrecisionAb Antibodies.

Fundamentals of Western Blotting Course #3: Immunodetection

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This simple tool allows users to keep track of their Western Blotting experiment from sample preparation to imaging.

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实验员小哈&Western blot 关于Blocking（封闭）的一些心得 - 哔哩哔哩

哈&Western blot 关于Blocking（封闭）的一些心得 - 哔哩哔哩实验员小哈&Western blot 关于Blocking（封闭）的一些心得实验员小哈

关注专栏/实验员小哈&Western blot 关于Blocking（封闭）的一些心得实验员小哈&Western blot 关于Blocking（封闭）的一些心得

2020年08月24日 23:57--浏览 ·

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实验员小哈粉丝：10.2万文章：11

关注又来填坑了。在我的western blot操作视频中，使用了一个神奇的成品blocking buffer，室温15分钟，封闭就做完了，封闭效果也不错，关键是省时间。可是，如果实验室没有成品buffer可以用，怎么办？通常，是用1X TBST配制5%的脱脂牛奶，室温，1～2小时。或者用1X TBST配制5%的BSA，室温，1～2小时。封闭结束后，用5%的BSA配制一抗稀释液，4度，过夜。赶时间的时候，可以试试37度，封闭半小时。不赶时间，或者做到封闭这一步的时候，天色已晚想下班，可以4度封闭过夜。---------以下是trouble shooting讨论--------背景高，排除了抗体因素，高度怀疑是封闭不全的情况，解决策略：放弃省时间的想法，优先尝试4度封闭过夜这个条件。换用不同的封闭剂。背景过于干净，条带弱，排除其它因素，怀疑是封闭过度的情况，解决策略：将1X TBST换成不含Tween-20的1X TBS来配制封闭液。降低牛奶或BSA的浓度。减少封闭时间。（这条不是很推荐。）换用不同的封闭剂。不过，，，封闭过度的情况不是很常见，不应该作为条带弱的时候优先考虑的情况。今天还是要祝大家的Western blot顺利！欢迎提出、讨论更多的关于Western blot的问题～本文为我原创本文禁止转载或摘编

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详细介绍WB的转膜和染色实验方案。包括凝胶中蛋白的可视化、转膜和显影方法。打印本实验方案。目录凝胶中蛋白的可视化转膜丽春红染膜膜的封闭一抗孵育二抗孵育显影

凝胶中蛋白的可视化在现阶段染胶可用于确定蛋白的迁移是否均匀一致。如果您计划将蛋白转印到膜上，则使用铜染色法，因为考马斯染色不可逆。考马斯染色仅适用于以下情形：在转膜后染胶检查转膜效率；不需要转膜，只需观察 SDS-PAGE 结果。考马斯染色切断电源后，分离的蛋白条带就会开始扩散（溶于水溶液）。为了防止蛋白的扩散，用 40% 蒸馏水、10% 醋酸、50% 甲醇的溶液处理凝胶，就会使大多蛋白沉淀（变得不可溶）。为了让固定的蛋白可视化，在相同比例的水/醋酸/甲醇混合物中加入质量比 0.25% 的考马斯亮蓝 R-250，然后将凝胶放置溶液中，在振荡器上室温孵育 4 小时至过夜。接下来将凝胶（保存染料；可重复多次使用）转移到 67.5% 蒸馏水、7.5% 醋酸、25% 甲醇的混合溶液中，放置在振荡器上，洗去多余的染料。染料不会结合丙烯酰胺，因此会被洗脱（留下干净的凝胶）。但是，染料会与凝胶中的蛋白紧密结合，显示为深蓝色。铜染色法用蒸馏水简单冲洗经新鲜凝胶（最多 30 分钟），然后转移至 0.3 M CuCl2 溶液染色 5–15 分钟。接下来用去离子水简单清洗凝胶，在暗视野背景下观察。蛋白在半透明蓝色背景下形成清晰条带。凝胶可以用 0.1–0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0 重复冲洗至完全脱色。根据转膜仪器制造商的说明，进行转膜。转膜转膜流程的详细说明可在转膜仪器制造商的网站上找到，根据系统的不同而有所区别。但是，每种方法的原理都一样。带电荷的蛋白（SDS 提供）在电场中可以在凝胶中移动，从凝胶转移到膜上，显示蛋白的“印迹”。早期的方法依赖于扩散；现在在电场中进行印迹是标准方法了。转膜可以湿转或半干转。湿转由于膜的干燥而更不容易失败，尤其推荐用于大蛋白转膜。在两种转膜方法中，膜都放置在凝胶旁边，两者夹在滤纸中间，整个三明治结构夹在固体载体之间，保持凝胶与膜之间的紧密接触。在湿转中，凝胶和膜紧紧地夹在海绵和滤纸之间（海绵 > 滤纸 > 凝胶 > 膜 > 滤纸 > 海绵），确保凝胶与膜之间不形成气泡。三明治结构浸泡在转膜缓冲液中，对其施加电场。负电荷蛋白向正极移动，结合在膜上，并阻止其继续移动。湿转的标准缓冲液与跑胶缓冲液所用的都是 1x Tris-甘氨酸缓冲液，但是没有 SDS，并加入了甲醇至终浓度 20%。对于分子量大于 100 kDa 的蛋白，推荐在转膜缓冲液中加入终浓度为 0.1% 的 SDS。在半干法转膜中，三明治由滤纸 > 凝胶 > 膜 > 滤纸组成，在转膜缓冲液中浸湿，直接放置在正负电极之间。在转膜中，膜靠近正极、凝胶靠近负极，这很重要。半干转的转膜缓冲液中 Tris 和甘氨酸的比例不一定与湿转一致，请参考仪器制造商的实验方案。标准配方是 48 mM Tris、39 mM 甘氨酸、0.04% SDS、20% 甲醇。有两种类型的膜：硝酸纤维素膜（NC膜）和 PVDF膜，实验效果都很不错。PVDF 膜要求进行预处理：将膜裁剪为合适的大小，然后在甲醇中浸泡 1–2 分钟。之后转移膜至冰冷的转膜缓冲液中孵育 5 分钟。未能在转膜缓冲液中平衡的膜会导致转印时皱缩、条带错位。小分子和大分子蛋白的转膜转膜缓冲液中 SDS 和甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度会影响转膜效率。如下调整可以增加转膜效率：大分子蛋白 (>100 kD)对于大分子蛋白，其在凝胶电泳时分离迁移较慢，从凝胶中转膜也很慢。因此跑胶时应该使用低浓度的凝胶，8%或更低。由于低浓度的胶易碎，所以操作时需十分小心。大分子蛋白易在凝胶里形成沉淀聚集，阻碍转膜。在转膜缓冲液加入终浓度0.1%的SDS，可以避免出现这种情况。由于甲醇易使SDS从蛋白上脱落，因此降低甲醇的浓度至10%或更低，可以防止蛋白沉淀。降低转膜缓冲液中甲醇的比例也会促使凝胶的肿胀，让大分子蛋白更容易转膜。只有使用NC膜时才必需使用甲醇。如果是 PVDF膜，在甲醇激活膜后，转膜缓冲液中可以不加入甲醇。选择湿转 4°C 过夜，不建议选择半干转。小分子蛋白 (<100 kD)SDS 妨碍蛋白与膜的结合，对于小分子蛋白更是如此。因此小分子蛋白的转膜，转膜缓冲液中可以不加 SDS。保持甲醇的浓度20%。对于500 kD 的蛋白，请参考下列文献的凝胶和缓冲液系统：Bolt MW and Mahoney PA (1997).High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.Anal Biochem, 247, 185–92.更多转膜提示：使用镊子，避免手指接触膜。手指上的油和蛋白会阻碍转膜，形成脏的印迹。将凝胶和膜夹在滤纸中间后，两者之间的气泡可以通过滚筒、移液管或者 15 mL 管滚压三明治结构来去除，或者在装有转膜缓冲液的盘中组装三明治结构，防止气泡形成。确保将滤纸和膜的大小剪裁得与凝胶一致。在半干转中，较大的突出会阻止电流通过膜。鸡来源的抗体会结合在 PVDF膜上，形成高背景。改用NC膜可以帮助降低背景染色。丽春红染色使膜上蛋白可视化要确定转膜的成功，用 TBST 洗膜。将丽春红母液按照 1:100 稀释。母液是 2% 的丽春红 S 加入 30% 的三氯乙酸和 30% 的磺基水杨酸制成。在丽春红染色液中孵育 5 分钟，然后用大量水冲洗直至水清澈、蛋白条带显现。该膜可以用 TBST 或水重复冲洗至完全脱色。对于 PVDF 膜，用甲醇重新激活后，再用 TBST 清洗。TBS 10x1 L 溶液；24.23 g Trizma HCl80.06 g NaCl 在 800 mL 蒸馏水中溶解用 HCl 将 pH 调至 7.6将体积加至 1 LTBST1 L 溶液；100 mL TBS 10x900 mL 蒸馏水1 mL Tween 20 Tween 20 很粘稠，会粘在枪头上。请确保在 Tris 缓冲液中加入正确的剂量。使用10% 的溶液比直接加入未稀释的 Tween 20 更容易操作。膜的封闭封闭膜可以阻碍一抗和/或二抗非特异性的结合到膜上（膜对蛋白有很高的结合能力，因此对抗体也有很高的结合能力）。通常使用两种封闭溶液：脱脂牛奶或 BSA (Cohn fraction V)。牛奶相对便宜，但是不推荐用于磷酸化蛋白的研究；牛奶中包含的酪蛋白是一种磷酸化蛋白，可能会导致抗体的非特异性结合，形成高背景。有些抗体对 BSA 封闭的膜比牛奶封闭的膜信号更强，原因还不清楚。查看数据表中的应用说明，看其中是否有封闭的具体说明。配置 5% 的牛奶或BSA 溶液，即在每 100 mL TBS 含 Tween 20 (TBST) 的缓冲液中加入 5 g 牛奶或 BSA。充分混合并过滤。不过滤可能会导致斑点，在显影时影响条带。在摇床上 4°C 孵育 1 小时。孵育后用 TBST 冲洗 5 秒。一抗孵育孵育缓冲液以建议稀释度在 TBST 中稀释抗体。如果数据表没有标明建议稀释度，设计稀释梯度 (1:100–1:3000)，并根据结果进行优化。抗体过量会导致非特异性条带。某些实验室习惯使用封闭缓冲液，而另一些实验室则使用不含封闭剂的 TBST 来孵育抗体。您可能会发现抗体缓冲液加或不加封闭剂，不同的抗体，结果也不尽相同，。如果没有高背景问题，用低浓度(0.5–0.25%)甚至完全不加牛奶或 BSA，有些抗体会产生更强的信号。孵育时间时间可能从几小时到过夜不等（不超过 18 小时），取决于抗体对蛋白的亲和力和蛋白丰度。我们建议抗体更高的稀释度、更长的孵育时间，确保特异性结合。孵育温度最好低温孵育。如果在封闭缓冲液中孵育过夜，必须在 4°C 孵育，否则会出现污染从而破坏蛋白（尤其是磷酸化基团）。建议在摇床上孵育，充分均匀覆盖膜，防止结合的不均匀。二抗孵育用 TBST 清洗膜数次，每次清洗 5 分钟或更长，去除残余一抗。孵育缓冲液与稀释度以建议的稀释度在 TBST 中稀释抗体。如果数据表没有推荐的稀释度，设计稀释梯度 (1:1,000–1:2,0000)，并根据结果进行优化。抗体过量会导致非特异条带。您可以在封闭缓冲液中孵育二抗，但是在降低背景时可能会牺牲特异性信号的强度，这可能是因为封闭蛋白会阻碍抗体目标蛋白的结合。孵育时间和温度摇床上室温孵育 1–2 小时。选择哪个偶联物？我们推荐辣根过氧化物酶 (HRP) 偶联的二抗，不推荐碱性磷酸酶 (ALP) 偶联的二抗，因为其灵敏度较低。显影方法检测试剂盒对于 HRP 偶联的抗体，通常使用加强的化学发光 (ECL) 试剂盒作为底物。我们提供不同检测灵敏度的 HRP 底物。X 射线胶片自动化 X 射线胶片仪，简单易用，被广泛使用。切记，过曝的胶片不适合进行分析，因为无法确定蛋白的相对量。且过曝的胶片会显现全黑条带，没有对比，有大量非特异性条带。数码拍照新一代显影仪内含摄像头，无需暗室。摄像头检测到膜上的化学发光，将信号转换为数码照片，并利用仪器提供的软件进行快速分析。现在市场上有一系列机器可以选用。处于下一代前沿的是不使用 HRP 偶联抗体（即化学发光）的系统。举个例子，STORM 分析仪检测来自荧光偶联二抗的荧光。Odyssey 红外成像系统检测红外荧光。

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目录无信号背景偏高多带现象背景有不均匀的白色斑点背景有黑色斑点深背景出现白色条带（非预期背景）分子量蛋白标准条带呈黑色目的条带染色过低/过高“微笑”条带相同的蛋白杂交出现大小不均匀条带凝胶染色不均匀

无信号一抗和二抗不匹配二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白使用高浓度抗体，延长 4℃ 孵育时间（如过夜）。封闭剂和一抗或二抗有交叉反应使用温和的去污剂如吐温-20，或更换封闭剂（常用的脱脂奶粉、BSA、血清或明胶）。一抗不识别测试物种中的蛋白参照说明书，比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目的蛋白会发生反应，设置阳性对照。抗原量不足每泳道蛋白上样量不低于 20-30 μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照。组织中目的蛋白含量低浓缩使信号最大化（例如检测核蛋白要用核裂解物）。转膜不充分使用可逆染色剂例如丽春红 S 检测转膜效果,检查转膜操作是否正确。PVDF 膜需预先浸在甲醇中，然后浸到转移缓冲液中。洗膜过度勿过度洗膜。一抗失效使用新鲜抗体，重复使用有效浓度会降低。二抗受叠氮钠抑制避免叠氮钠和 HRP 标记抗体一起使用。检测试剂盒过期和底物失活使用新鲜的底物。背景偏高未进行非特异性封闭或封闭不充分延长封闭时间，考虑更换合适的封闭剂。Abcam 推荐 5% 脱脂奶粉、3% BSA 或血清封闭 30 分钟。这些可以包含在抗体缓冲液中。一抗浓度过高稀释抗体至合适浓度，以更高稀释度抗体孵育更长时间（耗时长但特异性结合最好）。孵育温度过高 4 ℃ 下孵育。二抗与封闭剂非特异性结合或反应设置二抗对照(不加一抗)。一抗或二抗与封闭剂有交叉反应在孵育和洗涤液中加入温和去污剂如吐温 -20。脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。使用 BSA 代替奶粉作为封闭剂。在孵育和洗涤液中加入温和去污剂如吐温 -20。脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。使用 BSA 代替奶粉作为封闭剂。未结合蛋白质洗涤不充分增加洗涤次数。膜的选择导致的高背景NC 膜比 PVDF 膜背景低。膜干燥。在孵育过程中防止膜变干，在任何步骤都保证膜有充分的反应液，放入搅拌子不断搅动或轻轻振荡使膜浸在溶液中，避免出现干膜现象。多带现象细胞传代次数过多，使其蛋白表达不同使用原始未传代的细胞株，和现在的细胞株一起做平行对照实验。体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等查阅文献，使用试剂使样品去磷酸化、去糖基化来验证翻译后的修饰。蛋白样本降解（蛋白质分子量降低）在样品缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂。检测到未经报道过的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白查阅其它文献报道，或 BLAST 搜寻，使用说明书推荐的细胞株或组织。一抗浓度过高，高浓度时常出现多条蛋白带降低抗体浓度和/或孵育时间。抗体未经纯化使用亲和纯化的抗体，减少非特异条带。条带为非特异性条带应用封闭多肽来区分特异性和非特异性条带，只有特异性条带能被封闭从而消失。靶蛋白形成多聚体SDS-PAGE 电泳上样前，煮沸 10 分钟而不是 5 分钟，使蛋白质解聚。背景有不均匀的白色斑点转膜时膜上有气泡或抗体在膜上分布不均转膜过程中尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动。背景有黑色斑点抗体结合了封闭剂。过滤封闭剂。深背景出现白色条带（非预期背景）一抗或二抗加入过多稀释抗体的浓度。分子量蛋白标准条带呈黑色抗体和分子量蛋白标准发生了反应在分子量蛋白标准和第一个样品之间增加一个空白条带。目的条带染色过低/过高分离不彻底。改变凝胶比例：分子量大的蛋白用低浓度胶，分子量小的蛋白用高浓度胶。“微笑”条带迁移速度过快。降低电泳电压。电泳温度过高（改变了 pH 值和迁移速度）降低迁移速度或低温电泳(冷库或冰上)。相同的蛋白杂交出现大小不均匀条带制备凝胶时凝胶凝固太快，致使泳道中丙烯酰胺的比例不均匀参照凝胶的配方，在凝胶中加入适量 TEMED，放置时在凝胶顶部加入适量 0.1% SDS（水稀释）以防凝胶变干。凝胶染色不均匀细菌污染4°C 保存抗体并使用新鲜的缓冲液浸泡凝胶。抗体量不足确保在振荡孵育时抗体充分浸没膜。浏览其它蛋白质印迹相关实验方案和技术。观看简单易懂的实验方案视频。

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蛋白质印迹法疑难排解指南

精心策划的实验，具有适当的控制、处理和条件，通常是获得改进结果的第一步。要了解有关规划蛋白质印迹实验的更多信息，请查看我们的蛋白质印迹实验指南。

问题

选择疑难排解的主题：

信号弱或无信号

多个条带或非特异性结合

拖尾效应

深色或黑色印迹

散斑或斑点样印迹

问题

可能的原因

建议

信号弱或无信号

重复使用预稀释的抗体

不建议重复使用稀释的抗体，因为稀释后的抗体稳定性较差，并且存放太久的稀释缓冲液容易产生微生物或真菌污染。我们建议始终使用新鲜稀释的抗体，以获得最适结果。

组织或细胞系中的蛋白表达水平低

我们建议使用 BioGPS 或 Human Protein Atlas 等表达谱分析工具以及科学文献，来查找细胞或动物组织是否预期能够充分表达目的靶蛋白。我们始终建议设置已知的阳性对照，以判断实验结果。如需了解我们许多抗体的推荐对照信息，请参阅我们靶标的阳性对照处理表。

对于全细胞提取物，每个泳道建议上样至少 20-30 ug 的蛋白，以便检测全组织提取物中的靶标总量/未修饰靶标量。然而，通常需要将总蛋白上样量增加到每个泳道至少 100 ug，以检测全组织提取物中的修饰靶标（如磷酸化和剪切靶标）。当组织中只有一小部分细胞含有翻译后修饰靶标时，全组织提取物可能需要上样更多蛋白。在细胞提取物中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，对于避免蛋白降解和维持蛋白得率至关重要。我们建议往裂解缓冲液中加入亮抑酶肽（最终浓度为 1.0ug/mL）和 PMSF (#8553) 作为蛋白酶抑制剂。还可以使用 Protease Inhibitor Cocktail (100X) (#5871) 或 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) (#5872)。

磷酸化或修饰蛋白的水平低

在未处理的细胞系或组织中，许多翻译后修饰蛋白的基底表达水平较低。我们建议使用 PhosphoSitePlus 查找与您特定修饰位点有关的使用低通量方法的文献，或使用我们靶标阳性对照处理表查找处理方法以及可作为阳性对照的细胞系或组织。

在细胞提取物中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，对于避免蛋白降解和维持蛋白得率至关重要。应将焦磷酸钠（最终浓度为 2.5 mM）和 β-甘油磷酸盐（最终浓度为 1.0 mM）作为丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂加入裂解缓冲液中。应加入正钒酸钠（最终浓度为 2.5 mM）以抑制酪氨酸磷酸酶。还可以使用 Protease Inhibitor Cocktail (100X) (#5871) 或 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) (#5872)。

举例：通过处理诱导磷酸化：使用 Phospho-IKKα/Β (Ser176/180) (16A6) Rabbit mAb 对用 TPA（#9905，80 nM，24 小时）进行分化，并用 1 μg/mL LPS 处理所示时间的 THP-1 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。磷酸化 IKKa/b 等某些靶标需要特定的处理条件才能达到最适表达水平。

分泌蛋白

某些靶蛋白会被细胞分泌至胞外，因此在全细胞提取物中无法有效检测到。分泌型靶标可使用丙酮进行沉淀或浓缩后的细胞培养基检测。在某些情况下，可使用 Brefeldin A (#9972) 等化学调节物抑制细胞分泌目的蛋白。

举例：检测分泌蛋白：使用 Cleaved Caspase-1 (Asp296) (E2G2I) Rabbit mAb #89332（上图）或 Caspase-1 (E2Z1C) Rabbit mAb #24232（下图）对未经处理 (-) 或经 Lipopolysaccharides (LPS) #14011（50 ng/mL，4 小时）处理后再经 Nigericin（15 μM，45 分钟）处理 (+) 的小鼠骨髓源性巨噬细胞 (mBMDM) 提取物或培养基进行蛋白印迹分析。剪切型半胱天冬酶-1 会被细胞分泌，因此与全细胞提取物相比，更容易在浓缩培养基中检测到。

抗体灵敏度和反应性

请查看抗体网页的“灵敏度/特异性”部分。敏感性仅为转染性或重组蛋白的抗体不足以检测靶标的内源性水平。内源性灵敏度抗体适用于所有样品类型（内源性、转染或重组蛋白）。另外，可能需要增加或减少抗体用量，以获得最适信号，具体取决于样品中的靶蛋白丰度。我们建议以产品网页和说明书上显示的稀释比作为优化的起点。

另一个需要考虑的因素是抗体的物种反应性。CST 已对产品网页“反应性”部分列出的物种进行了内部验证。如果您的目的物种未列出，请联系我们的技术支持团队，他们将非常乐于帮助您确定抗体与您模型物种的蛋白序列的预期反应性。

裂解不完全

无论使用哪种裂解缓冲液，CST 都建议进行超声处理，以确保充分裂解和最大/一致的蛋白回收率。超声处理对于确保膜结合和细胞器（如胞核和线粒体）靶标的高效蛋白提取是必不可少的，并且还能剪切会干扰 SDS-PAGE 凝胶电泳的胞核 DNA。建议使用探头超声波仪进行最适的样品制备。对于 1 mL 样品，在冰上用 Microtip 探头超声波仪以 15W（或 50% 功率）进行 3x 10 秒破碎。但较好的其他方案是重复通过细（如 24 号）针反复抽吸或用玻璃珠涡旋。超声处理后，对样品进行离心，对不溶性细胞碎片进行沉淀，并用上清液用于进行蛋白印迹实验。

缓冲液选择不佳

要使抗体获得最适结果，请参阅产品网页上的蛋白免疫印迹实验步骤，了解推荐的一抗稀释缓冲液（即 BSA 或牛奶）。如果没有用推荐的稀释缓冲液孵育抗体，可能会严重损害结果的特异性/灵敏度。例如，脱脂奶粉对于我们许多一抗孵育而言，条件过于严苛。一般来说，CST 建议使用 1X TBS/0.1% Tween-20/5% 脱脂奶粉进行封闭和二抗孵育，以尽量减少非特异性背景。使用其他封闭剂，如明胶、血清、无蛋白封闭剂、酪蛋白、或混合封闭剂，可能降低靶标信号强度。

许多研究者对使用脱脂奶粉作为稀释缓冲液来检测磷酸化蛋白表示担心。具体来说，人们认为牛奶中的酪蛋白会导致高背景。在 CST，我们在使用脱脂奶粉检测磷酸化蛋白时未发现任何问题。所有 CST 抗体在上市前均用 5% 脱脂奶粉和 5% BSA 进行了检测，并且选择了最适稀释缓冲液作为推荐缓冲液。

封闭、抗体孵育（一抗和二抗）和洗涤缓冲液均应使用 1X TBS/0.1% Tween-20 配置。较高或较低百分比的 Tween-20 会影响结果的敏感度/特异性。使用 PBS 而非 TBS 可能会降低我们某些抗体的信号强度。

举例：孵育缓冲液比较：使用 5% 脱脂奶粉 + 1X TBS/0.1% Tween-20（左图）和 5% BSA + 1X TBS/0.1% Tween-20（右图）稀释的FcγRIV (E8I7C) Rabbit mAb #73741在4°C 下孵育过夜，对 J774A.1 细胞提取物进行蛋白印迹分析。用脱脂奶粉溶液进行一抗孵育会导致某些抗体的信号显著减弱。

转移条件不佳

我们通常建议在 4°C 下用 25mM Tris、192mM 甘氨酸和 20% 甲醇以 70V (200-250mA) 进行湿转移，持续 2 小时。但对于高分子量蛋白，我们建议将转移缓冲液中的甲醇含量降至 5-10%，并将 70V 下的转移时间延长至 3-4 小时 (200-250mA)。对于半干式转移，请参阅制造商的建议。

对于低分子量蛋白，务必要避免过度转移或“穿过”（小分子量靶标）。我们建议缩短转移时间，并使用孔径为 0.2 um 的硝酸纤维素转移膜，以最大程度减少低分子量（即小于 25-30 kDa）蛋白的流失。

多个条带或非特异性结合

同工型反应性

某些细胞系和组织模型可以包含多种蛋白同工型或剪接变体，它们可以迁移至不同的分子量。请参阅抗体网页上的“特异性/灵敏度”部分，确定是否能预测检测或确认检测到多种同工型。还可以在 UniProt 上查阅目的蛋白，看看是否列出了多个同工型序列。

翻译后修饰

翻译后修饰 (PTM) 会导致部分靶蛋白的电泳速率与未修饰蛋白不同。因此，诱导或抑制某些翻译后修饰的处理条件会导致在蛋白印迹中观察到多个条带。糖基化、SUMO 化、泛素化和磷酸化便是修饰的例子，这些修饰可能导致蛋白印迹上出现多个条带，具体取决于使用的样品和处理方法。如果您正在查找更多靶蛋白相关的 PTM 信息，请参阅 PhosphoSitePlus。

组织样品

组织样品是非均质的（即由不同细胞类型组成），所以在其它样本（如细胞系）中检测不到非特异性条带的抗体，在组织样本中检测到非特异性条带的概率相对较高。此外，某些组织模型可能含有多种蛋白同工型或剪接变体，它们可以迁移至不同的分子量。

裂解物降解

样品中的蛋白酶和磷酸酶会快速降解蛋白。在裂解物中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂，有助于减缓或防止蛋白降解。我们建议往裂解缓冲液中加入亮抑酶肽（最终浓度为 1.0ug/mL）和 PMSF (#8553) 作为蛋白酶抑制剂。还可以使用 Protease Inhibitor Cocktail (100X) (#5871) 或 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) (#5872)。

裂解物的长时间存放还可导致蛋白降解物增加，而蛋白降解物会通过抗体检测到。确保使用新鲜样品，以最大程度减少蛋白降解。在同一瓶样品中，某些蛋白的稳定性不如其他蛋白，因此，尽管一个样品可能可检测出某个靶蛋白，但同一样品中可能有不同的蛋白已有降解。

例子：蛋白降解：使用 β-Catenin (D10A8) XP® Rabbit mAb #8480 对用未添加蛋白酶抑制剂（左图）或添加 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5872（右图）的裂解缓冲液制备并且在 37°C 下孵育所示时间的 NIH/3T3 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。在没有蛋白酶抑制剂的情况下，β-Catenin 信号在收样后 3 小时内逐渐减弱，表明发生了蛋白降解。在有蛋白酶抑制剂混合物的情况下，β-Catenin 降解明显减弱，并且信号在采集后 20 小时仍然存在。

例子：蛋白降解：使用 β-Catenin (D10A8) XP® Rabbit mAb #8480 对用未添加蛋白酶抑制剂（左图）或添加 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5872（右图）的裂解缓冲液制备并且在 37°C 下孵育所示时间的 NIH/3T3 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。在没有蛋白酶抑制剂的情况下，在采集后 3 小时内，β-Catenin 信号逐渐减弱，表明蛋白被降解。在有蛋白酶抑制剂混合物的情况下，β-Catenin 降解明显减弱，并且信号在采集后 20 小时仍然存在。

高蛋白浓度

如果使用高灵敏度抗体，膜上过量的蛋白会导致出现多个条带和高背景，且整个泳道中的信号强度过高，而这些是蛋白量较少时不会存在的。尝试上样更少的蛋白，以观察更清晰的信号。

曝光时间长

如果蛋白上样量太少，这会导致难以检测到目的蛋白，尤其是在样本类型中丰度较低的情况下。这反过来会导致需要延长曝光时间，以检测印迹上的靶蛋白。同时使用常见的 ECL 试剂时，CST 抗体经配制可在两分钟的曝光时间内产生信号。如果在该时间段内未观察到信号，则可能需要更高的蛋白浓度。

一抗稀释缓冲液不佳

一抗稀释缓冲液会影响膜背景。例如，与 BSA 相比，缓冲液（如脱脂奶粉）在降低印迹上的非特异性条带和总背景方面能起到更好的作用。但牛奶对于某些抗体而言可能过于严苛，会导致靶标信号减弱。请务必参考 CST 产品网页上推荐的蛋白免疫印迹实验步骤，选择合适的一抗稀释缓冲液（即 BSA 或脱脂奶粉）。一般来说，CST 建议使用 1X TBS/0.1% Tween-20/5% 脱脂奶粉进行封闭和二抗孵育，以尽量减少非特异性背景。

举例：孵育缓冲液比较：使用 5% 脱脂奶粉 + 1X TBS/0.1% Tween-20（左图）和 5% BSA + 1X TBS/0.1% Tween-20（右图）稀释的 IL-33 (E2T5L) Rabbit mAb #88513 在4°C 下孵育过夜，对 NCI-H1666 细胞提取物进行蛋白印迹分析。使用 BSA 溶液进行一抗孵育会使某些抗体产生高背景。

拖尾效应

糖基化蛋白

不同的糖基化通常导致在分子量高于预测的分子量处产生条带拖尾效应。靶蛋白中糖基化的潜在位点可见于 PhosphoSitePlus。将您的样本使用 PNGase F处理，一种在糖蛋白上剪切N-聚糖的酶，也可确认分子量变化是否因糖基化产生。

举例：蛋白糖基化导致的条带拖尾：使用 CD83 (D8V7V) Rabbit mAb #99075（上图）或 Β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图）对未经处理 (-) 或经 PNGase F 处理 (+) 的 HDLM-2 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。未经处理的泳道中的拖尾效应表示存在糖基化 CD83。用PNGase F - 一种在糖蛋白上剪切N-聚糖的酶-处理后，条带变清晰，表明这是去糖后的蛋白。

裂解物降解

裂解物的长时间存放还可导致蛋白降解物增加，而蛋白降解物会通过抗体检测到，在分子量低于预期的靶标分子量时出现拖尾效应。确保使用新鲜样品，以最大程度减少蛋白降解。如果需要长期储存，我们建议将裂解物储存在 -80°C，以减少降解。在同一瓶样品中，某些蛋白的稳定性不如其他蛋白，因此，尽管一个样品可能可检测出某个靶蛋白，但同一样品中可能有不同的蛋白已有降解。

裂解不完全

深色或黑色印迹

高浓度二抗

使用太多二抗（即辣根过氧化物酶）和更灵敏的检测试剂 [如我们的 SignalFire™ Elite ECL Reagent (#12757)] 时，会出现伴有或不伴有反白“鬼影”条带的黑色印迹。这最好通过增加 HRP 偶联二抗的稀释度（例如，从 1:2000 到 1:10,000）解决。

举例：二抗过多导致暗印迹：使用 p44/42 MAPK (Erk1/2) (3A7) Mouse mAb #9107 和稀释度增加的 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076 对稀释的 HeLa 细胞提取物进行蛋白印迹分析。高灵敏度检测试剂，如 SignalFire™ Elite ECL Reagent #12757，二抗浓度更高时，可能导致背景更高，。

洗涤不充分

洗涤时间缩短可能致使过多抗体残留在膜上，导致化学发光曝光后形成暗印迹。CST 建议在用一抗和二抗孵育后，用 1X TBS/0.1% Tween-20 常温洗涤三次，每次五分钟，以获得最适的结果。

缓冲液选择不佳

使用封闭缓冲液以及是否加入其他去垢剂均会影响膜背景。例如，与 BSA 相比，缓冲液（如脱脂奶粉）在降低印迹上的非特异性条带和总背景方面能起到更好的作用。但牛奶对于某些抗体而言可能过于严苛，会导致靶标信号减弱。请务必参考产品网页上推荐的蛋白免疫印迹实验步骤，为一抗孵育选择适当的稀释缓冲液（即 BSA 或脱脂奶粉）。一般而言，CST 建议使用 1X TBS/0.1% Tween-20/5% 脱脂奶粉进行封闭和二抗孵育，以最大程度减少非特异性背景。

膜复水

为了获得最适性能，我们建议直接将硝酸纤维素膜放在转移缓冲液中复水。但使用 PVDF 时，在将膜移至转移缓冲液之前，应将膜放在甲醇中短暂复水。

散斑或斑点样印迹

转移海绵污染

长时间未经过适当消毒的转移海绵可能含有细菌污染物。要排除这个因素，请使用新的转移海绵。

缓冲液污染

存放天数较多的缓冲液可能有更多细菌和真菌污染物，这些污染物会导致膜上出现斑点。我们建议始终使用新鲜配制的缓冲液，以获得最适效果。

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血泪教训，Western blot史上最全避雷手册。 - 知乎

血泪教训，Western blot史上最全避雷手册。 - 知乎首发于Western blot踩雷和制作大全切换模式写文章登录/注册血泪教训，Western blot史上最全避雷手册。聊点学术AI病理+量化病理方案设计提起Western blot (WB)，很多人都能哭诉半宿。这是一个基础实验，也是一个让大家头疼的实验，简称“玄学”。话不多说，做过的都懂。今天给大家提供WB最全避雷手册，希望大家能愉快实验，顺顺利利。倾尽全力，长文预警1、WB有什么优点？答：灵敏，可达ng级，用ECL显色法可达pg级。灵敏，相对便宜且特异性高。2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？答：a) 你的细胞中并不表达这种蛋白质，换一种细胞或查文献弄清楚； b)你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性； c) 你的抗体不能识别目的蛋白，检查抗体说明书，看是否有问题。3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：a)有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS的浓度，同时将样品煮沸时间延长，一般需96℃以上10-15min左右； b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时需再加入适量上样缓冲液。4、我做的蛋白质分子量很小(10KD左右)，请问怎么做WB？答：尽量选择0.2μm的膜，缩短转移时间；也可将两张膜叠在一起再电转。5、我的目的带很弱，怎么加强？答：最主要是加大抗原上样量；同时也可以将一抗稀释比例上调。6、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间和温度(尽量4℃过夜，此孵育条件比37℃1h要温和很多)，并提高封闭液浓度。7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换新进口的显色底物。8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中本身含双氧水，不稳定，见光或温度高时易失活；现配现用。c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 二抗时间过期，或平时使用不当导致二抗失活。9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作，看是否有改善.；b) 显影时间过长，一般3-5分钟就够了，特殊情况需摸索显色时间。10、DAB好还是ECM好？答：DAB有毒，但是比较灵敏，是HRP最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到检测的阀值，就特别灵敏，可以检测pg级抗原。具体选择还是要看你实验的情况，目前大家一般使用ECM。11、抗原检测出的分子量比资料上的大，是怎么回事？答：a)所检测的抗原形成二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。b)蛋白本身有修饰如糖基化、磷酸化等均会增大蛋白分子量。12、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker 转上去了，为什么？答：可能是：a)样品浓度过低；b)转移时间不够。(注意！Marker并不是蛋白是否转移到膜上的标准，它只是为我们提供简单的指示作用。)13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。建议可多种抑制剂混合使用。14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和WB试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？答：a)免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；WB可以特异性检测某个蛋白质分子，如抗体选择合适，灵敏度很高。WB进行定量，但是不能定位。b)两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。15、做WB时，提取蛋白后冻存(未加蛋白酶抑制剂)，用了一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了一种一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？答：怀疑是样品问题，可能是：a)样品不能反复冻融，建议制备好样品后混匀，小体积分装；b)样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查WB过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂(PMSF在水溶液中不稳定，30min就会降解一半，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF，样品处理超过1小时，补加1次。见水易分解，使用前加入)。16、细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB？答：一般5×10^6就足够了；特殊情况需根据自己的研究来确定。17、同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对WB有无影响？答：能，完全没有问题；这是两个不同的实验。18、同一蛋白样品能同时进行两种因子的WB检测吗？答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品；有时如果抗体特异性高且效价高，同时使用2种一抗，可在一张膜上检测2种不同蛋白。19、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性；部分膜蛋白不好提取，尤其是亚细胞器的膜蛋白。可考虑最新的invent柱式提取法，提取效率高，蛋白丢失较少。20、我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以减少电流延长时间，加20％甲醇；还有一种办法就是采用最新的WES来检测，灵敏度极高，但价格贵。21、想分离的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作WB吗？答：200kd的蛋白不好做，分离胶用7％，积层胶 3.5％。这种分子量蛋白建议加大电泳电转的电场强度和加长作用时间，但必须控制温度，保证低温电泳和电转。22、如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的，建议尽量不超载加样。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，以增大上样孔体积，可以试1.5mm厚的胶。23、蛋白变性后可以存放多久？答：-80℃，若没有反复取出冻融，保存一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。24、我所测定的蛋白分子量是100KD左右，按理说分离胶应当采用7.5%，但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？答：上述提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意目的条带位置肯定会发生一定地偏移。25、二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含较多的生物素，用BSA(5%、8%)代替会好一点。26、一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？答：WB一般上样30-100μg不等，结果跟目的蛋白的表达丰度、上样量、一二抗的量以及孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了。当然有的蛋白不适合WB的怎样做也不行，或者抗体效价低则注定事倍功半。27、做组织样品的WB的时候，怎样处理样品？答：必须进行研磨、匀浆、超声处理(注意降温)，蛋白质溶解度会更好，离心要充分(12000转/min，10-15min)。膜蛋白必须用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。28、大分子量蛋白200KD或以上，在做WB要注意什么呢？答：做200KD蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；胶很软，剥胶时要小心；转移时间需要相应延长(至少300mA，3h或以上)；必须要使用大量程的Marker(否则出现杂带不知如何分析问题)。29、有什么方法可以提高上样量？答：a)可以浓缩样品；或增大上样体积来增大上样量；b)用5X的上样缓冲液来稀释变性。30、蛋白的上样量有没有什么具体的要求？答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的WB则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超载。31、一抗，二抗的比例是否重要？答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉大部分的非特异性底色。32、要做磷酸化某因子WB，其二抗有何要求？答：主要是一抗要选择好。对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。33、免疫组化和WB可以用同一种抗体吗？答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称抗原表位)，有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，蛋白煮后变性其构象会消失，仅剩下一级结构。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般我们做的时候没有这么复杂的考虑，多看看抗体说明书所注明的实验范围来做，这样省时省力。34、WB中抗体的可以重复应用吗？答：所有的抗体工作溶液一般不主张回收冻存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用，4度保存，避免反复冻融。35、在做WB时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。36、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？答：肯定可以，建议先检查非磷酸化蛋白，然后使用抗体洗脱液将抗体洗去，再在该膜上重新孵育磷酸化一抗。37、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好，为什么？答：这是正常的，大分子的蛋白转移很慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡(转过的表现)。注意一点：丽春红染色较好，不是你的目标蛋白成功转移至膜上的标准，这是两个概念，；丽春红染色很多时候只是提供一个粗略的参考而已。38、做WB时，同样的抗体在免疫组化能做出，而WB却不能？答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做WesternBlot和免疫组化。39、如果是6×8转印膜，要加多少一抗？答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3-5ml。建议尽量还是裁剪膜，不要整张膜孵育，费抗体而且可能会孵育不均匀(个人建议，仅供参考)。40、上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。答：无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液；小编发现电泳时产热也很厉害，其实可以在电泳时加冰浴。41、跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？答：没有问题，就是你胶里的水分被电泳产热蒸发了。其次配好的胶在过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点电泳液保持湿度就可以了；也可能30%聚丙酰胺有问题，你可以重新配制一份试试或直接买商用的30%聚丙酰胺；能够替换的试剂，尽量换一下，选用进口试剂。42、蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？答：这么广的分布不好转移，一般建议：21KD和66KD可以一起转，一起做。采用12％SDS-PAGE，湿转120mA，45-60min就可以了，可以根据你实验室师兄师姐的调节；而170KD蛋白用7%SDS-PAGE，至少200mA 120min。43、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜(0.2μm)。44、我用的是可视Marker，但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。Marker是新买的。答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择，现在已经有商用梯度胶了，大家可自行选择。45、是否WB实验半定量一定要加内参？答：对于发表文章的实验一定要加内参，实验严谨，证据充分。46、核内抗原WB内参选择什么合适？答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，动动手查查就可以选出你要的内参。(也可以私信小编哦)47、做半定量WB，内参β-actin，GAPDH哪个好？答：一般选用β-actin就可以，也可以使用GAPDH，但是如果做能量、代谢这方面的研究还是尽量选择β-actin。48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持冰浴，保持低温。除非有文献特别指明必须使用特殊方法，一般来说没有区别。49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST的T是Tween吗，浓度是多少？答：T就是Tween，全称Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST)，组成：8g NaCl，2.42g Tris base，加水800mL充分溶解, 加 500-1000μL 的 Tween-20，用HCl 调节pH 至 7.4，加水定容至 1L。50、封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如在室温里做，或者要在4度下?答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。小编建议尽量还是4℃过夜孵育，原因在上面已说明。51、请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。52、怎样才能跑出漂亮的胶，泳道都能很直，上样的量和灌胶是否很重要，电压有什么要求？答：影响跑胶跑的质量，提供2个小建议：a)小电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶55V，分离胶75V就能跑得很好，但是实验的时间会很长。b)胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀(不要有气泡)，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶。53、为什么提高大分子量蛋白的转移的时候，小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?答：小分子的蛋白在转移过程中，会透过膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透过去了。54、电泳中常出现的一些现象：①“︶” 条带呈笑脸状原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好；电泳系统温度偏高，而且电场强度太大(电泳的电场大致呈现U形，所以因为赶时间而加大电压可能会出现这个)。②“︵” 条带呈皱眉状原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。③条带拖尾原因：样品溶解不好，或存在一定程度地蛋白降解。④纹理(纵向条纹)原因：样品中含有不溶性颗粒，可能抽提蛋白时出了问题。⑤条带偏斜原因：电极不平衡或者加样位置偏斜，一定要子平面台子上电泳，胶要做好。⑥条带两边扩散原因：加样量过多，弥散至孔周围了，减少上样量或者使用5X上样缓冲液。55、WB结果中背景较高可能的原因及建议：①膜封闭不够，建议延长封闭的时间；选择合适的封闭液。②一抗稀释度不适宜，太高，选择最适宜的抗体稀释度。③ 一抗孵育的温度偏高，建议4℃过夜孵育。④选择的膜容易产生高背景，一般NC膜的背景会比PVDF膜低，但是NC膜吸附力也就差了一点。⑤膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过，实验过程中要注意保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。⑥检测时曝光时间过长，可减少曝光时间。56、WB结果中杂带较多可能的原因及建议：①目的蛋白存在多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点等等)，本身可以出现多条带。查文献或生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，去除修蛋白饰后确定蛋白实际大小，这个需要一定的生物化学基础和生信分析能力。②目的蛋白有其它剪切本，查阅文献或生物信息学分析其可能性。③样本处理过程中目的蛋白发生降解，加入蛋白酶抑制剂；样本处理在冰上操作。④上样量过高，过于敏感，适当减少上样量。⑤一抗特异性不高，重新选择或制备高特异性的抗体。⑥一抗不纯，纯化抗体。⑦一抗或者二抗浓度偏高，适当降低抗体浓度。57、WB结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议：①你所检测的样本中不表达目的蛋白，选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性，同时查阅文献。②检测样本低表达目的蛋白，提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。③转移不完全或过转移，可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。④抗体不能识别测试种属的相关蛋白，购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。⑤一抗孵育时间不足，建议4℃结合过夜。⑥二抗与一抗不匹配，选择针对一抗来源的种属的抗体。⑦洗膜过度，洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。58、其它现象：①膜上多处出现黑点或黑斑，原因有2点，抗体与封闭试剂发生非特异性的结合；或者配的奶粉没有充分溶解，奶粉团粘在膜上而没洗干净。②反白(条带显白色)，原因一般是目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。③蛋白分子量偏低或偏高，原因：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。59、安全爱护身体，保护自己。安全第一，实验第二。安全无小事！操作有毒试剂时，一要定带手套和口罩，且操作挥发性试剂一定要在通风橱中进行。This is the dividing line.以上为本期内容。简单地为大家提供一些建议，希望大家的实验能顺顺利利，早日完成SCI大业。发布于 2020-09-03 08:58蛋白质分子生物学实验赞同 119757 条评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录Western blot踩雷和制